Khi được hỏi: “Ai là người đã phát hiện ra DNA”, rất có thể nhiều người sẽ không ngần ngại trả lời: Francis Crick và James Watson. Thực tế thì những nghiên cứu ban đầu về DNA đã được thực hiện trước công trình của hai nhà khoa học này khá lâu, cuối thế kỉ 19. Bài viết này điểm lại một vài cột mốc đáng nhớ trong hành trình DNA bước vào thế giới sinh học phân tử với tư cách là vật chất mang thông tin di truyền.
Năm 1869, Friedrich Miescher (1844-1895), nhà vật lí trẻ tuổi người Thụy Sĩ đã lần đầu tiên tách chiết được một loại dịch có trong nhân tế bào. Sau khi thu được các tế bào bạch cầu (leucocyte) từ mủ của các bệnh nhân trong một phòng khám địa phương gần nhà, Miescher phá hủy tế bào bằng dung dịch kiềm và thu được một chất kết tủa. Ông gọi chất này là “nuclein”. Sở dĩ gọi như vậy bởi nuclein có thành phần chính là nhân tế bào (nucleus). Ở thời điểm đó, ngoài việc xác định được hàm lượng lớn phosphorus trong nuclein, các tính chất sinh hóa của chất này vẫn còn là một bí ẩn. Ông dự đoán rằng nuclein tham gia đáng kể vào sự di truyền các tính trạng, nhưng cũng tin tưởng mạnh mẽ rằng một loại phân tử đơn thuần không thể giải thích được sự đa dạng và phức tạp của sự sống. Đáng lẽ ra, công trình của Miescher phải được lích sử xem như cột mốc lớn đầu tiên trên con đường khám phá DNA. Tuy nhiên, theo như những gì mà Edwin Chargaff đã ghi chép lại trong một bài review về lịch sử nghiên cứu DNA của mình, thì đến năm 1961, Darwin được nhắc đến 31 lần, Thomas Huxley 14 và Miescher không một lần nào.
Albrecht Kossel là cái tên đi tiên phong trong việc xác định thành phần hóa học của các nucleic acid. Ông bắt đầu những nghiên cứu trên nuclein của mình vào năm 1879, và không lâu sau đó ông phát hiện rằng ngoài thành phần protein chiếm hàm lượng lớn, ở nuclein tồn tại một hợp chất khác hẳn protein – nucleic acid. Từ năm 1885 đến 1901, ông và các học trò, bằng phương pháp thủy phân (hydrolysis) và nhiều kĩ thuật khác nhau đã phân loại thành công 5 thành tố của nucleic acid, chúng là: adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T) và uracil (U), trong đó DNA chứa T và không chứa U còn RNA thì ngược lại. Ông nhận giải Nobel Sinh lí và Y học năm 1910 cho công trình này.
Năm loại thành tố của DNA
Giai đoạn sau đó là một thời gian dài các nhà khoa học tranh luận với nhau xung quanh vấn đề: Nucleic acid hay protein là vật chất mang thông tin di truyền? Thực tế thì ở thời kì này, đại đa số tin rằng vai trò này phù hợp hơn với protein. Một trong nhà khoa học chia sẻ quan điểm đó là Phoebus Levene (1869-1940), người đã đưa ra “Giả thuyết tetranucleotide”. Thực ra đóng góp của Levene không chỉ giới hạn ở giả thuyết mà ngày nay người ta đều biết là sai lầm này, ông còn là người đầu tiên tìm ra 3 thành phần chủ yếu của DNA: một trong 4 loại base chứa nitrogen, một nhóm phosphate (-PO4) và một đường loại ribose thuộc nhóm đường mạch vòng 5 nguyên tử carbon. Sau đó Levene tiến thêm một bước nữa khi dự đoán mô hình polynucleotide của DNA mà trong đó nucleic acid được mô tả như chuỗi các nucleotide mà mỗi nucleotide thuộc một trong 4 loại căn cứ theo loại base mà nó sở hữu.
Phoebus Levene
Điểm đặc biệt với giả thuyết tetranucleotide là ở chỗ: theo ý tưởng này thì phân tử DNA là một chuỗi lặp lại của các “tetramer” – bộ 4 nucleotide A, T, G và C sắp xếp ở 4 đỉnh của hình vuông như ở Hình 2 và chúng liên kết với nhau theo một thứ tự duy nhất, chẳng hạn A-T-G-C-A-T-G-C và cứ như vậy. Vì lặp lại một cấu trúc duy nhất nên số lượng các nucletide sẽ là gần bằng nhau. Ông khẳng định chắc nịch khi công bố giả thuyết này năm 1919 rằng: “Những dữ kiện và bằng chứng mới có thể gây ra vài thay đổi cho nó [giả thuyết tetranucleotide], nhưng không có nghi ngờ gì về mô hình polynucleotide của nucleic acid ở nấm men”. Dĩ nhiên là nếu như giả thuyết này đúng thì quả thật DNA quá đơn giản để có thể trở thành mật mã di truyền cho thế giới sống. Mọi chuyện xảy ra đúng như vậy và giới khoa học dường như yên tâm với những gì Levene đề xuất và thế là, không mấy ai quan tâm đến câu chuyện liên quan đến DNA nữa. Cần nhắc đến một yếu tố ảnh hưởng không nhỏ đến niềm tin của giới nghiên cứu thời đó: uy tín của Levene. Ông là người đã phát hiện ra đường ribose vào năm 1909 và 20 năm sau là đường deoxyribose, hai loại đường xuất hiện trong RNA và DNA. Ông cũng có hơn 700 bài báo khoa học mô tả về cấu tạo hóa học của nhiều hợp chất khác nhau.
Giả thuyết Tetranucleotide của Levene.
Mọi chuyện chìm vào quên lãng cho đến năm 1928, Frederick Griffith, một y sĩ quân y người Anh đã tiến hành thí nghiệm với những con vi khuẩn Streptococcus pneumoniae (phế cầu khuẩn) gây ra chứng tràn dịch màng phổi – một đại dịch đã được O’ Henry, nhà văn người Mỹ nhân cách hóa một cách khá trang trọng là “Mr. Pneumonia” trong truyện ngắn Chiếc lá cuối cùng (The Last Leaf) nổi tiếng của mình. Ông phát hiện thấy có 2 chủng (strain) khác nhau: một chủng có lớp vỏ polysaccharide và tạo khuẩn lạc nhẵn (smooth), kí hiệu S gây chết chuột (virulent), trong khi chủng R có lớp vỏ polysaccharide tạo khuẩn lạc nhăn (rough) lại không gây chết (non-virulent). Thí nghiệm được tiến hành như sau:
– Đầu tiên, Griffith tiêm vi khuẩn chủng S vào chuột, chuột chết.
– Tiếp đến ông tiêm vi khuẩn chủng R vào chuột, chuột sống.
– Sau đó, Griffith xử lí nhiệt gây chết vi khuẩn chủng S, và tiêm nó vào chuột. Chuột sống bình thường.
– Cuối cùng, ông trộn lẫn nhóm vi khuẩn S đã chết này với nhóm vi khuẩn R sống rồi tiêm vào chuột. Kết quả: chuột chết.
Thí nghiệm của Grifith
Tại sao nhóm vi khuẩn S đã chết lại có thể gây bệnh cho chú chuột? Đây là một phát hiện thực sự bất ngờ, như thể chúng ta ngồi cạnh một người bạn và rồi tóc của ta đổi màu để phù hợp với màu tóc của họ vậy. Cũng vậy, bằng cách nào đó, các vi khuẩn S đã “biến đổi” các vi khuẩn R vô hại để chúng có thể gây chết chuột thí nghiệm. Như vậy, phải có một thứ gì đó của những con vi khuẩn S đã được “truyền tải” sang những con vi khuẩn R. Câu hỏi tiếp theo được đặt ra là “nhân tố bí ấn” đó là gì? Thí nghiệm này đã trở thành một thí nghiệm kinh điển được dạy trong hầu hết các cuốn sách giáo trình di truyền học phân tử, và ở đó nó mang một cái tên mới: biến nạp (transformation). Tuy vậy, ở thời điểm mà Griffith công bố kết quả thí nghiệm, người ta chỉ có thể tạm gọi “chất” này bằng cái tên “transforming principle”.
Câu chuyện sáng tỏ hơn vào năm 1944, khi mà Oswald Avery (1877-1955) cùng với hai cộng sự là Colin McLeod (1909-1972) và Marlyn McCarty (1911-2005) thực hiện một loạt thí nghiệm để chứng tỏ “transforming principle” mà Griffith tìm ra chính là DNA. Phương pháp họ đã sử dụng khá đơn giản. Để dễ hình dung, chuyện này tương tự như việc bạn bị dị ứng sau khi ăn một món rau trộn và không biết nguyên liệu nào là thủ phạm. Bạn sẽ làm thế nào? Có lẽ cách hay nhất là làm lại món ăn đó và mỗi lần bỏ đi một loại nguyên liệu. Quá trình này chấm dứt khi bạn không còn bị dị ứng nữa. Lúc đó bạn có thể kết luận rằng thủ phạm chính là nguyên liệu mà bạn mới bỏ đi ở lần “thí nghiệm” gần đây nhất. Đó chính xác là phương pháp mà ba nhà khoa học này đã thực hiện: biết rằng trong vi khuẩn có protein, lipid, đường, DNA, RNA…, họ phân hủy để loại bỏ lần lượt từng chất bằng các enzyme như protease, lipase, RNAase, và biết rằng carbohydrate không bị kết tủa bởi rượu – trong khi “transforming principle” có. Cuối cùng, DNA được xác định là nhân tố quyết định tính gây bệnh ở chủng S đã được truyền sang chủng R. Bộ ba nhà khoa học xuất bản bài báo của họ với nhan đề “Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types” trên tờ Journal of Experimental Medicine.
Thí nghiệm của Avery, McLeod và McCarty
Đây thực sự là một phát hiện đột phá vào thời điểm đó, tuy nhiên, có lẽ vì e ngại sự phản đối từ giới khoa học “lão làng”, những gì Avery và các đồng nghiệp kết luận ở cuối bài báo là khá thận trọng, đến mức lập lờ. Một mặt ông khẳng định rằng hiện tượng biến nạp (transformation) là cần được hiểu trên một quan điểm di truyền, nghĩa là chất truyền từ chủng S sang chủng R có liên quan trực tiếp với gene, còn protein vỏ của vi khuẩn được coi là một sản phẩm của gene. Mặt khác ông cũng đưa ra vài giải thích theo hướng nước đôi, ví dụ như: “có thể có một chút tương đồng giữa hoạt tính của “transforming principle” và virus”.
Năm 1944, thế giới đang rung chuyển bởi Chiến tranh thế giới thứ hai, các quốc gia tham chiến (trong đó có USA) có vẻ quá bận rộn với chiến sự nên phát hiện của ba nhà khoa học nhận được ít sự chú ý. Vả lại, cho đến lúc này giới khoa học vẫn thấy rất khó khăn để loại bỏ ý nghĩ rằng protein là vật chất di truyền, bởi lẽ protein được cấu thành từ 20 loại amino acid, trong khi những “viên gạch” xây nên DNA chỉ bao gồm 4 loại: A, T, G, C. Người ta mới chỉ rõ về chức năng của protein chứ DNA thì chưa ai biết chắc chắn đóng vai trò gì đối với sự sống.
Nhưng họ cũng không thể chối cãi được lâu về vai trò của DNA như là “transforming principle” mà Griffith mô tả khi Alfred Hershey (1908-1997) và Martha Chase (1927-2003) thành công với thí nghiệm nổi tiếng mang tên họ vào năm 1952. Thí nghiệm này được thực hiện trên một đối tượng khá đơn giản: virus. Cần nhớ lại rằng khi một virus thuộc dạng tan (lytic) xâm nhập vào một tế bào vi khuẩn (lúc này virus được gọi là phage., đầu tiên chúng bám vào bề mặt ngoài cùng của tế bào vi khuẩn. Tiếp đến, thông tin di truyền của virus được truyền vào tế bào và chỉ đạo quá trình nhân lên của hàng nghìn virus mới trong tế bào. Kết quả là cuối cùng tế bào vật chủ vỡ ra (lyse), giải phóng các virus mới.
Hershey và Chase quan tâm đến chất được tiêm vào tế bào vi khuẩn tại thời điểm ban đầu xâm nhập. Họ dùng một chủng phage có tên là T2, chứa DNA chứ không phải RNA, và sau đó thiết kế một thí nghiệm để kiểm tra xem liệu rằng vật liệu di truyền là DNA hay là protein. Ở thí nghiệm này hai nhà khoa học đã sử dụng kĩ thuật đánh dấu đồng vị phóng xạ (radioisotopic labeling). Đồng vị 32P đã được sử dụng để đánh dấu DNA vì phosphorus chỉ có nhóm phosphate của DNA còn 35S được sử dụng cho đánh dấu protein vỏ vì sulfur chỉ tồn tại trong các amino acid loại cysteine và methionine của chuỗi polypeptide. Bởi vì 32P và 35S phát ra những hạt mang năng lượng khác nhau khi chúng phân rã (decay), nên hai đồng vị này dễ dàng phân biệt với nhau.
Sau khi cho các phage T2 tiếp cận tế bào vật chủ, các tế bào này được lắc mạnh để đánh bật protein vỏ của các phage T2 ra khỏi bề mặt tế bào. Công đoạn tiếp theo là ly tâm (centrifugation) để thu được dung dịch phân pha, trong đó đồng vị 35S lắng xuống cùng với vỏ capsid của phage T2 trong khi đồng vị 32P nổi lên trên. Qua hai bước đánh dấu (a và b), kết quả thu được thật rõ ràng: DNA chứa thông tin di truyền mà các phage T2 đã “tiêm” vào tế bào vi khuẩn chứ không phải protein vỏ của chúng.
Cấu trúc và ảnh hiển vi của virus T2
Thí nghiệm Hershey-Chase
Ngay ở năm tiếp theo, ngày 25/4/1953 bài báo “Molecular structure of nucleic acid: a structure of deoxyribose nucleic acid” của Crick và Watson được đăng trên tạp chí Nature đánh dấu một bước tiến dài trên con đường khám phá các thuộc tính của DNA. Trước đó, Linus Pauling, nhà hóa học và vật lí nổi tiếng từng đoạt giải Nobel đã đưa ra một mô hình DNA dạng “triple helix”, nghĩa là DNA gồm 3 vòng xoắn lại với nhau. Tuy nhiên Watson và Crick, sử dụng ảnh chụp nhiễu xạ tinh thể tia X đã phủ nhận tiên đoán này và đưa ra mô hình mà chúng ta được học ngày này. Cấu trúc không gian của DNA đã được mô tả hoàn chỉnh: một chuỗi xoắn kép (double helix) quay quanh một trục tưởng tượng mà trên đó các nucleotide được liên kết với nhau theo chiều ngang bởi liên kết hydro: A luôn liên kết với T bởi 2 liên kết và G với C bởi 3 liên kết, theo Nguyên tắc bổ sung (complementary rule) được Edwin Chargaff phát hiện ra năm 1950 sau khi thống kê số lượng của bốn loại nucleotide ở nhiều loài sinh vật. Theo chiều dọc, liên kết phosphodiester là yếu tố giữ các nucleotide dính với nhau, và các phân tử đường deoxyribose cộng với nhóm phosphate đóng vai trò tạo nên “khung xương” (backbone) cho toàn bộ phân tử. Mỗi mạch đơn của DNA có 2 đầu: đầu 3’ chứa nhóm –OH tự do ở vị trí nguyên tử C số 3, trong khi đầu 5’ chứa nhóm –PO4 tự do ở vị trí nguyên tử C số 5.
Cấu trúc không gian của phân tử DNA, mô tả bởi Crick và Watson
Các phân tử và liên kết hóa học trong phân tử DNA
Nhưng các nghiên cứu xác định vật liệu di truyền vẫn chưa chấm dứt. Nhớ lại rằng ở thí nghiệm Hershey-Chase, hai nhà khoa học đã sử dụng T2 là một loại virus chỉ chứa DNA và protein, nên họ dễ dàng kết luận DNA là vật liệu di truyền ở T2. Thế còn những chủng virus không chứa DNA thì sao? Chúng lưu trữ và truyền đạt thông tin di truyền bằng cách nào?
Năm 1957, Heinz Fraenkel-Conrat (1910-1999) và cộng sự đã phân lập thành công virus khảm thuốc lá (tobacco mosaic virus – TMV) từ lá cây này. Họ cũng phân lập được Holmes ribgrass virus (HRV) từ cây Plantago. Đây là hai loại virus mà thành phần chỉ bao gồm RNA và vỏ protein. Trong công đoạn này, họ đã cố tình tách riêng RNA và protein của hai loại virus. Bằng cách trộn protein của virus này với RNA của virus kia, những con virus lai được tạo ra. Bước tiếp theo là bước then chốt, khi Fraenkel-Conrat tiến hành lây nhiễm cây thuốc lá bởi virus lai chứa RNA của HRV và vỏ protein của TMV. Và bởi vì cả hai chủng virus này đều gây ra những nốt đốm trên bề mặt lá của cây bệnh do diệp lục bị biến tính, nên khi quan sát được những đốm mang đặc trưng của HRV, ông kết luận ngay rằng chính là RNA đã quy định các đặc tính ở virus chứ không phải protein.
Thí nghiệm của Fraenkel-Conrat
Như vậy, qua gần một thế kỉ, niềm tin ban đầu rằng protein tự mã hóa và đóng vai trò là vật chất di truyền đã bị bác bỏ. DNA mới giữ nhiệm vụ này ở hầu hết các cơ thể tế bào, đơn bào cũng như đa bào. RNA được một số loài virus sử dụng làm vật chất di truyền (ví dụ HIV, HRV, TMV…). Sự sống, một phạm trù vô cùng phức tạp và tinh tế lại có thể được “mã hóa” bởi một thứ ngôn ngữ hóa học chỉ bao gồm bốn chữ cái. Nhưng liệu đây có phải toàn bộ câu chuyện trong bức tranh toàn cảnh về sự phong phú của thế giới sống? Bài viết tiếp theo sẽ bàn cụ thể hơn về vấn đề này.
Keine Kommentare:
Kommentar veröffentlichen